研究紹介（引頭）

自然免疫応答を制御する分子機構に関する研究

Toll様受容体の細胞内シグナル伝達を制御するオートファジー

　Toll様受容体（TLR）は、微生物の構成成分、あるいは生体内の異常に伴って発現する内因性分子を認識し、細胞内のシグナル伝達を発動することにより、炎症を誘導する応答、あるいは抗ウイルス性の応答を誘導することができる受容体群です。侵入してきた病原体を即座に排除し、異常を解消することにより、生体の恒常性を維持するための自然免疫系においては、なくてはならない重要な役割を担っています。その一方で、Toll様受容体による炎症誘導応答が過剰になり過ぎると、感染部位などで組織の傷害・破壊が進み、生体の恒常性維持において大きく不利になることもあります。そのため生体にはTLRの応答を過剰にしないための様々な機構が備わっていることが明らかになってきています。私はTLRのシグナル伝達が誘導される際、細胞内シグナル伝達を過剰に起こさない分子メカニズムについて研究しており、オートファジー（autophagy；自食作用）と呼ばれる機構に関連する分子が重要な役割を果たしていることを見出しました。
　
　オートファジーは細胞内に存在する不要な分子や細胞内小器官などをリソソームの消化作用により分解し、細胞の恒常性を維持するための機構として知られています。細胞内に微生物が感染している場合には、細胞内の微生物を分解・排除するのにも役立っています。この機構はTLRのシグナル伝達後に形成されるシグナル伝達分子の複合体（シグナロソーム）に対しても働き、シグナルの発生を抑制することが分かりました。TLRがシグナル伝達を行う際にTLRに会合するアダプター分子MyD88はMyddosome（ミッドソーム）と呼ばれるシグナロソームを形成し、下流のシグナル伝達を活性化させることが知られています。この際、顕微鏡下でもMyD88が凝集する様子がみとめられますが、時間経過とともに巨大な凝集塊として細胞内に蓄積することがあります。このような現象の誘導機構や意義などについては長らく未解明のままでしたが、私はこの現象にSQSTM1とHDAC6という分子が関与することを明らかにし、これがシグナル伝達を過剰にしないための調整機構であることを明らかにしました（文献1, 2）。TLRのシグナル伝達では、シグナル伝達分子の「ユビキチン化」とよばれるタンパク質の翻訳後修飾が起こり、これを認識する分子が集合して下流のシグナルを動かしていきます。SQSTM1やHDAC6はユビキチンと結合する領域をもっており、本来シグナルを引き起こす分子と競合することでシグナルの発生を抑制し、さらにSQSTM1やHDAC6が結合した分子塊はオートファジーで優先的に分解される目印になっているため、次々に分解されていくことになります。頻度は低いですが、分子塊が凝集しすぎて分解されにくくなる現象も見られますが、これが顕微鏡下で観察されるMyD88の凝集塊だった訳です。
　
　その他、「基礎的オートファジー」とよばれるオートファジーが単量体の状態で存在するシグナル伝達分子MyD88を分解し，炎症シグナルの発生を抑制していることを見出しました。この分解を遮断すると、細胞内にMyD88が蓄積し始め、細胞外からの刺激とは無関係に自己活性化を引き起こし、弱い炎症シグナルが発生することを見出しました（文献3）。
　
1) Into T., et al. Regulation of MyD88 aggregation and the MyD88-dependent signaling pathway by sequestosome 1 and histone deacetylase 6. J. Biol. Chem., 285(46): 35759-35769 (2010)
2) Into T., et al. Autophagy in regulation of Toll-like receptor signaling. Cell. Signal., 24(6): 1150-1162 (2012)
3) Into T., et al. Basal autophagy prevents autoactivation or enhancement of inflammatory signals by targeting monomeric MyD88. Sci. Rep., 7: 1009 (2017)　

口腔の感染防御機構における自然免疫の役割に関する研究

口腔領域でToll様受容体の細胞内シグナル伝達に依存して産生される抗菌因子

　TLRは自然免疫系で重要な働きを担っていますが、口腔における働きについては明らかになっていません。私は口腔領域、特に唾液において、TLRの働きに依存して産生される抗菌因子があるのではないかと予測しました。そこでTLR下流のシグナル伝達を開始させるアダプター分子MyD88の遺伝子ノックアウトマウスを用い、唾液腺での遺伝子発現に異常がみられるかどうか調査を行いました。その結果、MyD88ノックアウトマウスでは唾液腺におけるSLPI（secretory leukocyte protease inhibitor；分泌型白血球プロテアーゼ阻害因子）などの抗菌因子の産生が減少しており、さらには唾液中のIgMやIgG3など抗体の含有量も低下していることが明らかになりました（文献4）。
　　
4) Into T., et al. MyD88 deficiency alters expression of antimicrobial factors in mouse salivary glands. PLoS One, 9(11): e113333 (2014)
　　

口腔領域で産生される抗菌ペプチドLL-37の役割

LL-37は陽性荷電をもつ抗菌ペプチドの一種であり、ヒトの口腔の自然免疫系で第一線の防御機構として重要な役割を果たしていることが示されています。私たちはLL-37にはTLRによって誘導される自然免疫応答を抑制する作用があることを見出し、そのメカニズムについて解析を行っています（文献5）。　
　　
5) Into T., et al. Effect of the antimicrobial peptide LL-37 on Toll-like receptors 2-, 3- and 4-triggered expression of IL-6, IL-8 and CXCL10 in human gingival fibroblasts. Cell. Immunol., 264(1): 104-109 (2010)
　

口腔領域に症状をきたす自己免疫疾患と自然免疫との関連性に関する研究

自己免疫性唾液腺炎の発症におけるToll様受容体シグナルの関連性

　自己免疫性唾液腺炎は自己免疫の機序で唾液腺組織にリンパ球浸潤と組織破壊がもたらされる疾患です。原発性シェーグレン症候群のように原発性に発症する場合や，全身性エリテマトーデス（SLE）や関節リウマチ，IgG4関連疾患に関連して二次的に発症する場合もあります。唾液腺組織破壊による唾液分泌低下により、口腔乾燥、咀嚼・嚥下障害、齲蝕や歯周病の増悪が起こり、また口腔感染症が起こりやすくなるため、QOLは著しく低下してしまいます。自己免疫性唾液腺炎に関するさまざまな研究が国内外で進められており、病態形成やリスクファクターに関して理解が進んでいますが、その一方で病態の多様性や発症機序の複雑性から、未だ唾液腺が侵される正確な原因の特定にまでは至っておらず、一刻も早い解明が望まれているところです。
　私たちは自己免疫性唾液腺炎における自然免疫系の役割、特にTLRのシグナル伝達を担うMyD88に着目して研究を行ってきました。自己免疫性唾液腺炎モデルマウスでMyD88を欠失させたところ、自己免疫性唾液腺炎の発症が抑制される傾向がみられました。最も顕著であったのは唾液腺内に異所性に形成される高内皮細静脈（HEV）の形成抑制効果でした。そこでHEV形成に関与するLTβRシグナルについて調べたところ、MyD88欠損によってシグナルが減弱することを見出し、これが病態形成に関連している可能性を見出しました（文献6）。
また、同マウスの唾液腺も用いて網羅的遺伝子解析を行ったところ、MyD88欠失させることで免疫機能に関連する遺伝子、特にインターフェロンで制御される遺伝子群の発現が野生型マウスと比べて減少することが明らかになりました。この結果は、MyD88がTLRの下流でインターフェロン産生性の応答に関わることを示唆しています。また、このような応答を引き起こすTLRは核酸認識型のTLRである、TLR7、TLR8、およびTLR9に限られることから、自己免疫性唾液腺炎の病態で主要な働きを担うTLRが凡そ想定できることになります（文献7）。
　　
6) Into T., et al. MyD88 signaling causes autoimmune sialadenitis through formation of high endothelial venules and upregulation of LTβ receptor-mediated signaling. Sci. Rep., 8: 14272 (2018)
7) Mori T., et al. Effect of Myd88 deficiency on gene expression profiling in salivary glands of female non-obese diabetic (NOD) mice. J. Oral Biosci., 63(2): 192-198 (2021)

歯周病関連細菌が自然免疫系を回避する機構・破綻させる機構に関する研究

Porphyromonas gingivalis のジンジパインに関連した研究

歯周病原細菌P. gingivalis は糖非発酵性の細菌であり、アミノ酸をエネルギー源としています。アミノ酸を獲得するために様々なタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を産生しており、歯周組織を構成するタンパク質や、歯肉溝滲出液中のタンパク質を分解します。私たちはこの細菌が産生するプロテアーゼの一種「ジンジパイン」が、好中球が過剰に活性化するのを防止したり抗菌作用を発揮するSLPIと呼ばれる因子を分解していしまい、生体防護作用を喪失させることで歯周病を増悪させている可能性について報告しました（文献8）。
　　
9) Into T., et al. Arginine-specific gingipains from Porphyromonas gingivalis deprive protective functions of secretory leukocyte protease inhibitor in periodontal tissue. Clin. Exp. Immunol. 145(3): 545-554 (2006)

自然免疫系を刺激する因子の特定とその役割に関する研究

　Toll様受容体（TLR）は、微生物の構成成分、あるいは生体内の異常に伴って発現する内因性分子を認識し、細胞内シグナルを活性化することにより、炎症を誘導する応答あるいは、抗ウイルス性の応答を誘導することができる受容体群です。TLRの他にも同様の働きを担っている受容体群がいくつか存在し、自然免疫系の働きを支えています。私たちはこのような受容体群で認識される口腔微生物由来の分子、あるいは口腔の異常に伴って発現する内因性分子の探索を行い、そのような分子が認識される免疫学的意義について考えながら研究を進めています。

　このような研究を進める中で最近抗菌因子LL-37が歯垢細菌を破壊することで細菌の細胞からDNAを放出させ、即座にDNAと結合して複合体を形成し、この複合体を歯垢に堆積させていることを発見しました。LL-37はDNAと複合体を作ると抗菌活性を失い、またLL-37が結合したDNAはDNA分解酵素による分解に耐性をもつようになります。このような複合体が堆積することで歯垢形成が促進されてしまう可能性があるのです。そして、この複合体は免疫細胞を刺激して炎症を引き起こす能力を有していることも見出しました。歯周病を引き起こすような細
菌のDNAとLL-37が複合体を作ると炎症誘導能は高くなり、一方、口腔レンサ球菌などの病原性をもたない細菌のDNAとLL-37が複合体を作ると、炎症誘導能はまったく無くなるばかりか、炎症を抑制する効果を発揮する可能性も見出しています。これらの発見は、今までまったく知られていなかった歯垢における宿主由来分子と細菌由来分子の相互作用を解明したというだけにとどまらず、新しい視点から歯垢の病原性を見直すパラダイムシフトを引き起こす可能性を秘めている重要な発見です（文献9）。

9) Tanabe G., et al. Role of LL-37 in oral bacterial DNA accumulation in dental plaque. J. Dent. Res. in press.

朝日大学歯学部口腔感染医療学講座口腔微生物学分野 Department of Oral Microbiology